Гельминтологические исследования объектов внешней среды. Сбор консервирование и пересылка гельминтов. Фиксация, окраска гельминтов и приготовление из них постоянных микропрепаратов. Приготовление музейных макропрепаратов

11843_01Гельминтами  животные заражаются  друг от друга через внешнюю среду – это помещения, предметы ухода, пастбища, навоз, почва, водоёмы, места водопоя, кормления и содержания, промежуточные и резервуарные хозяева гельминтов.

Заражённое гельминтами животное является источником распространения инвазии, а внешняя среда, содержащая яйца и личинки гельминтов, — источник непосредственного  заражения животных гельминтами. В связи с этим очень важно проводить в определённые сроки диагностические исследования объектов внешней среды с целью прогнозирования той или иной инвазии.

Исследование почвы. Вблизи животноводческих помещений и на пастбище, с поверхности и глубоких слоёв почвы (до 20 см) берут несколько проб по 50-100 г каждая. Перемешиваем и берём среднюю пробу.

50 г почвы помещаем в центрифужную пробирку на    250 мл, добавляют 150 мл воды, перемешивают до однородной гомогенной массы. Центрифугируем 3 минуты при 600 оборотах в минуту. Воду сливают, а к осадку  добавляем 150 мл нитрата натрия (плотность 1,39), перемешиваем и центрифугируем 3 минуты. Можно использовать магния сульфата и хлористого натрия насыщенные растворы. Далее добавляют насыщенный раствор до образования выпуклого мениска, покрывают обезжиренным предметным стеклом и оставляем на 30 минут. Яйца гельминтов всплывают и прилипают к стеклу. Стёкла снимают и наносят на них несколько капель 50 % раствора глицерина, накрывают  покровным стеклом  и исследуют  под микроскопом. Можно и без центрифугирования яйца гельминтов оставляют на 1 час  и собирают проволочной петлёй, отмывают при неоднократном отстаивании и отсасывают пипеткой верхний слой жидкости. Личинки в почве выявляют методом Бермана. Пробы берут в количестве 200-400 г. Существуют и другие методы исследования почвы, например, (метод обмучивания почвы по М.П.Гнединой)  — личинки стронгилят.

Исследование навоза. Подстилочный навоз исследуют также как и почву. Пробы навоза из навозосборников и отстойников рекомендуют брать из 3-5 точек поверхностного, среднего и нижнего слоёв, пробоотборником А.Д.Черепанова и добавляют 3-5капель толуола. Пробы твёрдой фракции берут 100 см3, а жидкой 500 или 1000 мл. Затем растирают, фильтруют, центрифугируют. Далее к осадку добавляют раствор натрия нитрата до образования мениска, сверху пробирки покрывают покровным стеклом и через 30 минут микроскопируют. Жидкую фракцию исследуют также.

 Исследование травы и сена. Личинки нематод могут мигрировать в вертикальном направлении  и горизонтально, по стеблям и листьям растений, но больше их скапливается в прикорневой части стебля. Собранную траву или сено разрезаем на части и исследуем по методу Бермана.

laboratornaya-diagnostika-gelmintozov_002Партениты трематод (адолескариев фасциол, паромфистомат)    собирают с растений  в биотопах – на влажных участках пастбищ. Их обнаруживают как невооружённым глазом таки под лупой (увеличение в 5-8 раз). Они имеют вид точек диаметром 0,3 мм; молодые адолескарии молочно-белого цвета, позднее они желтеют, а затем становятся буро-коричневыми. При микроскопии находят в цистах подвижных паразитов с двумя присосками, глоткой и кишечными стволами.

Исследование   водоёмов. Берут не менее 10 литров воды, профильтруют её через сатин или фильтровальную бумагу. Фильтр помещают в кюветку, а осадок с него соскабливают предметным стеклом, смешивают с несколькими каплями 50 % водного раствора глицерина и просматривают под малым увеличением микроскопа. Если осадок густой, его исследуют по методу Фюллеборна, причём и плёнку поверхностную и осадок.

Во внешней среде (почва, вода) обитают свободноживущие нематоды и их личинки, которых иногда принимают за личинки гельминтов. Для их дифференциации используют раствор формалина. Личинок помещают в воду на часовое стекло или чашку Петри. При добавлении 40 % раствора формалина в соотношении 1 : 25, свободноживущие  личинки погибают через 12 минут, а личинки паразитических нематод в 95 % случаев остаются подвижными.

Исследование беспозвоночных различных промежуточных хозяев возбудителей гельминтозов – это моллюски, дождевые черви, насекомые, ракообразные, паукообразные.

Беспозвоночное  животное или части его тела кладут на предметное стекло, покрывают другим  предметным, сдавливают и микроскопируют. Есть метод ускоренных массовых исследований6

— переваривание промежуточных хозяев в искусственном желудочном соке (соляная кислота 7 мл, пепсина 5 г, воды 100 мл) при температуре 37-39оС в течение нескольких часов. В осадке остаются живые личинки;

— выявление личинок нематод беспозвоночных (метод Дарлинга).

Исследование моллюсков: в чашке Петри или на часовом стекле вскрывают моллюсков, освобождая их от раковины остроконечными ножницами. Тело расчленяют на части и  органы исследуют компрессорным методом. При вскрытии малого прудовика отрезают верхушку раковины, где находится печень и в ней развиваются подвижные церкарии молочного цвета похожие на головастика. Они имеют ротовую и брюшную присоски, глотку, кишечные стволы. Моллюски являются промежуточными хозяевами трематод и некоторых видов нематод.

Исследование насекомых. Муравьёв собирают вблизи муравейников на растениях в оцепеневшем состоянии. Брюшко отделяем, а затем в капле воды расщепляют иглами под микроскопом. В них обнаруживают от единиц до 100 метацеркариев. Муравьи являются промежуточными хозяевами цестод птиц и дополнительными – дикроцелий жвачных и др.

Исследование жуков. Их собирают в густой траве,  под навозными кучами, мусором и других местах. Их вскрывают и содержимое тела исследуют компрессорным методом. В брюшной полости жуков локализуются цистицеркоиды цестод птиц. Они яйцевидной формы, 0,5 мм длины, на сколексе – присоски и  1-2 ряда крючьев. Они являются промежуточными хозяевами макроканторинхусов свиней. Личинки их (акантеллы) видны невооружённым глазом, они белого цвета, 3-5 мм длиной.

Исследование мух. Мух, собранных с животных усыпляют эфиром и помещают в каплю физиологического раствора. При помощи препаровальной иглы вскрывают и исследуют компрессорным методом под микроскопом. Личинок телязий находят в брюшке, инвазированных личинок – в хоботке и голове. Мухи-коровницы – промежуточные хозяева телязиоза жвачных и лошадей; муха-жигалка, гематобия – промежуточный хозяин парафилляриоза лошадей. Личинки парафилярий развиваются в полости тела и жировом теле гематобий. Инвазионных личинок обнаруживают в грудном отделе, в голове и хоботке жигалки.

Исследование комаров. Собранных с животных комаров вскрывают иглами на предметном стекле в капле физраствора и исследуют компрессорным методом под микроскопом. Они являются промежуточными хозяевами возбудителя сетариоза лошадей, крупного рогатого скота, буйволов, зебу. Инвазионные личинки сетарий мигрируют в грудки, в головку и хоботок комара.

Исследование мошек и мокрецов производят также как и комаров. Они являются промежуточными хозяевами онхоцерков крупного рогатого скота  и лошадей.

Исследование стрекоз и их личинок. Их вскрывают в небольшом количестве воды. Метацеркарии крупные – 0,5 и >мм, округлой форм, непрозрачные, при воздействии молочной кислоты или глицерина можно видеть внутренние органы личинок трематод. Стрекозы являются дополнительными хозяевами трематод птиц.

Исследование панцирных клещей производится на предметном стекле в капле воды, покрывая покровным стеклом. Для выявления цистицеркоидов клещей просветляют в глицерине или слегка придавливают покровным стеклом до их деформации, в результате чего цистицеркоиды выходят из тела клеща. Они шаровидной формы (0,2 мм), имеют сколекс с присосками и шейку. Орибатидные клещи – промежуточные хозяева мониезий жвачных, аноплоцефалид однокопытных и других. Клещи обитают на увлажнённой почве пастбищ и лесистой местности.

Исследование ракообразных (водяных осликов, дафний (водяные блохи), циклопы и др.). Они являются промежуточными хозяевами для многих видов гельминтов – цестод, нематод, скребней и трематод. Методика исследования: внешний осмотр, вскрытие и компрессорный метод или перевариванием в искусственном желудочном соке, а деле – ларвоскопия (по Берману). Цистицеркоиды локализуются в полости тела бокоплава. Водяные ослики являются промежуточными хозяевами возбудителя филиколлёза и тетрамероза уток. Акантеллы филиколлиса видны невооружённым глазом при исследовании рачка с брюшной стороны. Они овальной формы, белого цвета, до 1 мм (в тёплой воде – до 2,5 мм).

Водяные блохи (дафнии) являются промежуточными хозяевами возбудителей эхинуриоза и тетрамероза уток и других птиц. Личинки спиралеобразно свёрнутые, локализуются в полости тела, вблизи головы и в основании конечностей.

Циклопиды и диаптомиды являются промежуточными хозяевами для многих цестод и некоторых нематод птиц, человека, плотоядных рыб. Цистицеркоиды цепней локализуются в полости тела циклопа над кишечником хорошо видны под микроскопом присоски и корона крючьев.

Исследование олигохет. Червей собирают вблизи свинарников и на выпасах. Убивают их 1 % раствором формалина, затем разрезают кутикулу, извлекают зоб, пищевод, мышечный желудок и др. и исследуют компрессорным методом под микроскопом на наличие личинок метастронгилюсов. Можно также использовать метод переваривания в искусственном желудочном соке. Личинки – (у молодых) на хвостовом конце имеется пуговка); вблизи хвостового конца имеется маленький кутикулярный шип; передний конец тупой. Дождевые черви являются также резервными хозяевами аскаридат и гетеракисов.

Сбор, консервирование и пересылка гельминтов.  Собранных гельминтов, перед консервированием отмывают в оде, физрастворе, где трематоды и цестоды (в том числе личинки) погибают и далее их помещают в пробирки с жидкостью Барбагалло (3 % раствор формалина на физрастворе; 30 частей формалина, 7,5 г хлористого натрия и 1литр воды). Трематод и цестод далее осторожно прессуют в 70 % спирте 30-40 минут в чашке Петри между двумя предметными стёклами. Далее гельминтов перекладывают в банку с 70 % этиловым спиртом. Нематод промывают в воде или физрастворе и переносят в сосуд с жидкостью Барбагалло. Акантоцефал (скребней) консервируют в 70 % спирте, предварительно их осторожно прессуют, чтобы выдавить хоботок для фиксации его в вытянутом положении.

Ларвоцист цестод – цистицерков, ценурусов, эхинококков и альвеококков, консервируют в жидкости Барбагалло.

Весь гельминтологический материал обязательно и тщательно этикетуруют. Этикетировка – одна из наиболее важных манипуляций при сборе гельминтов. При этом необходимо тщательно и аккуратно, в процессе полного гельминтологического вскрытия, бросать в каждый цилиндр (кювет) временную этикетку с указанием названия вида животного, номера вскрытия и названия органа. После того, как гельминты собраны, вложены в пробирку и законсервированы, необходимо внутрь этой же пробирки вложить постоянную  этикетку, которую пишут на плотной бумаге, тушью или мягким карандашом. На этикетке должно быть указано следующее: вид животного, пол, номер вскрытия, локализация и предварительное определение; на обороте этикетки отмечают: местность, дату вскрытия, кем собран материал и количество найденных гельминтов.

Все отмеченные на этикетке данные должны быть занесены в особый журнал гельминтологических вскрытий. Собранный, законсервированный и за этикетированный материал должен храниться в особой посуде, предохраняющей его от высыхания, то есть в банке с притёртой пробкой, заполненной консервирующим раствором. На дно укладывается вата, плотно устанавливают пробирки с гельминтами в 2-3 яруса, перекладывая ватой. В таком виде они сохраняются длительное время. Материал упаковывают в деревянный ящик. Патологические препараты фиксируют в 10 % растворе формалина; по истечении 2-3-х дней их можно отправлять без жидкости – органы заворачивают во влажную марлю, а затем упаковывают в плотный ящик. Фекалий больных животных, на случай длительного хранения рекомендуют заливать 25 % раствором формалина. На посылке обязательно должна быть этикетка с указанием в ней соответствующих данных.

Фиксация, окраска гельминтов и приготовление из них постоянных микропрепаратов. Для детального изучения анатомо-морфологических особенностей гельминтов их специально окрашивают, просветляют, помещают в различные среды и т.д. Окрашивают преимущественно трематод и цестод. Для трематод используют квасцовый кармин: на 100 мл 5 % раствора калийных квасцов в дистиллированной воде прибавляют 2-3 г кармина, смесь кипятят 30-50 минут. После остывания раствор краски фильтруют через бумажный фильтр и добавляют кристаллик тимола или фенола. Краску используют как в неразведённом виде, так и   разбавленной водой (1:2-3).

Консервированные трематоды отмывают в воде 6-7 час – 24 часа. Затем прессуют между предметными стёклами в 70 % спирте 2-24 часа. Затем снова отмываем в воде 6-24 часа и удаляют избыток воды (на фильтровальной бумаге). Приготовленные  таким образом трематоды помещают в краску от 1 минуты до нескольких часов (и на сутки), контролируя под микроскопом или лупой. Из краски их переносят в воду и от 1 минуты до 1 часа тщательно отмывают, оттягивая влагу фильтровальной бумагой и проводят через спирты возрастающей крепости для обезвоживания: в 50 % спирте – 5-10 минут, в 60 % — 10-15 минут, в 70 % — 15-20 минут, в 85 % — 20-30 минут и в 96 % спирте  — 1-10 часов. Далее трематод просветляют, помещают на предметное стекло, заключают в канадский или пихтовый бальзам, силикатный клей.

Цестод окрашивают также квасцовым кармином, краску разбавляют 1: 2. Техника окраски цестод та же, что и трематод.

Для учебных и научно-исследовательских целей из нематод делают временные препараты путём просветления их в смеси молочной кислоты, глицерина и дистиллированной воды (поровну). Мелких нематод помещают на предметное стекло, наносят несколько капель жидкости и покрывают покровным стеклом, выдерживают несколько часов (до суток) и исследуют. Более крупных (аскарид, стронгилят) помещают на часовое стекло в чашку Петри, бюксы с молочной кислотой и выдерживают 3-5 дней.

Из нематод можно также приготовить постоянные учебные и музейные препараты. Для этого пользуются методом Пренделя. Нематоды, фиксированные жидкостью Барбагалло, последовательно проводят через смеси спирта с глицерином, крепость которых постоянно возрастает. Первая смесь – 40 % спирт 20 мл + глицерин      2 мл; вторая – 50 % спирт + глицерин 5 мл; третья — 60 % спирт 20 мл + глицерина 6 мл; четвёртая – 70 % спирта 20 мл + 10 мл глицерина. В первых трёх жидкостях  нематод выдерживают 24 часа, а в 4-й – до тех пор, пока не испарится весь спирт и гельминты останутся в глицерине (2-3 дня в термостате 37оС). Далее гельминтов помещают на предметное стекло, избыток глицерина удаляют, а нематод заливают глицерин-желатиной (расплавленной на водяной бане). Препарат покрывают покровным стеклом, этикетируют и хранят в специальных папках или деревянных коробках.

Для приготовления макропрепаратов из органов животных, поражённых различными гельминтами, используют методы, применяемые при изготовлении обычных патологоанатомических музейных препаратов. Органы извлекают из трупа животных, тщательно очищают их от слизи, крови и других посторонних элементов. Помещают в соответствующую посуду и наполняют 5 % раствором формалина, но они при этом теряют свою естественную окраску и становятся серыми. Для сохранения естественной окраски имеются специальные растворы. Наиболее часто употребляют растворы по методу Кайзерлинга. Орган помещают в формалино-солевой раствор (формалина 200 мл, азотно-кислого калия (селитра) – 15 г; уксусно-кислого калия -30 г, воды дистиллированной 1 литр), выдерживаем в нём от 1-2 суток до 3-4 недель. Далее промываем в проточной воде несколько часов. Обсушивают и помещают в  90-96 % спирт ректификат или денатурат. Восстановление цвета наступает в первые часы, после чего препарат нужно быстро удалить из спирта, иначе может наступить обесцвечивание.

Для постоянного хранения орган помещают в жидкость следующего состава: глицерина 200 мл, уксусного калия 800 г (или 200 г), воды дистиллированной 1000мл. Кромку банки (цилиндра) смазывают подогретой менделеевской замазкой и закрывают крышкой.

Метод Шора.  Обработанный для фиксации орган, помещают в спирто-солевой раствор: вода дистиллированная 1000 мл, спирт этиловый 96 % – 150 мл, хлористый натрий 100 г. В кипящей воде растворяют соль, фильтруют через вату, после охлаждения добавляют спирт. Окраска сохраняется почти без изменения.

Обработка акантоцефалов. Их изучают после просветления в глицерине или кедровом масле (молочная кислота не пригодна). Для этого их переносят из 70 % спирта в 50 % водный раствор глицерина, а затем в чистый глицерин. Это только для изучения хоботка и крючочков. Для более чёткого выявления структуры других органов рекомендуется просветлять скребней в кедровом масле, после полного обезвоживания гельминта путём проведения его через спирты возрастающей концентрации.

Для приготовления гельминтоовоскопических препаратов яйца гельминтов можно заделывать в глицерин-желатин. Яйца гельминтов помещают на предметное стекло; покровное стекло с небольшим количеством глицерин-желатина слегка подогревают до расплавления глицерин-желатина, а затем этим стеклом быстро накрывают предметное стекло с яйцами гельминтов. Края покровного стекла обводят канадским бальзамом, лаком или замазкой.

С.Л.Санкин, вместо глицерин-желатина, рекомендует использовать 1-2 капли жидкости Барбагалло, покрыв препарат покровным стеклом, а края покрыть канадским бальзамом, лаком или замазкой.